Hjemtag (download) pdf-filen aktuel-naturvidenskab-3-2000.pdf (~400 kb) PDF-filer skal læses med en pdf-reader. Du kan f.eks. bruge Acrobat Reader Xpdf eller GSview
13
A k t u e l N a t u r v i d e n s k a b | 3 | 2 0 0 0
Vores brug af ukrudtsmidler,
pesticider, er ikke uden proble-
mer. Disse kemikalier kan trænge ned i grundvandet, og i flere tilfælde har EU's grænse- værdi for indhold af pesticider på 0,1 µg/l været overskredet. Som følge heraf er der i perio- den 1987-1998 lukket mere end 200 drikkevandsboringer. Det er især stoffet 2,6-dichlor- benzamid, også kaldet BAM, der har været årsag til luknin- ger, men der er også fundet andre pesticider i grundvandet. BAM er ikke et pesticid i sig selv, men et nedbrydningsprodukt fra ukrudtsmidlet dichlobenil. Mange af de pesticider, der er fundet i grundvandet, er i dag blevet forbudt at anvende. Di- chlobenil blev således forbudt i 1997, men BAM må alligevel forventes at forurene vores grundvand langt ud i fremti- den. Den tid, der går, fra regn
falder på jordoverfladen, og til
det når grundvandet, er nemlig meget lang. Transporttider på 20 år eller mere er ikke ualmin- delige. Dette betyder, at mange af de pesticider, der måske i dag er blevet forbudt, alligevel også i fremtiden vil forurene vores grundvand. Stofferne er simpelt hen ikke nået derned endnu.
For at sikre rent drikkevand,
der overholder EU's grænse-
værdier for pesticider, bruges der mange penge på rutinemæssige pesticidanalyser. Analyser udføres som oftest på kommercielle labo- ratorier ved brug af avanceret analyseudstyr som f.eks. væske- og gaskromatografi. Der stilles i dag krav om, at de anvendte ana- lyser har en følsomhed der er 10 gange lavere end EU's grænse- værdi, dvs. at følsomheden skal være helt nede omkring 0,01 µg/l. Prisen for en pesticid- analyse er meget høj. En enkelt
screeningsanalyse, der inklude-
rer f.eks. 8 pesticider, koster ty- pisk 1600 kr. Visse pesticidana
-
lyser er dog særligt vanskelige at
udføre, og i sådanne tilfælde er analyseprisen væsentligt højere. F.eks. koster en analyse for stof- fet glyphosat, der er aktivstoffet i ukrudtsmidlet Round Up ty- pisk 3000 kr. Da der samtidig er et ønske om at udføre stadigt flere pesticidanalyser, er der stor interesse for at udvikle nye og billigere analysemetoder.
Inden for de seneste år er for-
skere begyndt at udvikle nye så-
kaldt immunkemiske pesticid- analyser . Her udnyttes det, at en mus ved injektion af små mængder pesticid producerer antistoffer mod pesticidet på nøjagtig samme måde, som når vi mennesker producerer anti- stoffer mod en influenzavirus. Antistofferne genkender speci- fikke kemiske strukturer på
pesticidmolekylet, og kan an-
vendes til udvikling af højføl- somme analysemetoder. Im- munkemiske analysemetoder har i lang tid været kendt inden for den medicinske verden, hvor de bl.a. bruges til diagnosticering af halsbetændelse, og princippet anvendes også i flere af de graviditetstests, der findes i dag.
Antistoffer mod pesticider
For at udvikle antistoffer mod
pesticider benytter man i dag de grundlæggende principper for en vaccination mod f.eks. influenza. I tilfældet med pesti- cider, benytter man mus, som får gentagene injektioner med en vaccine, som består af et protein med pesticider på over- fladen (se boks B). Grunden til, at pesticiderne skal kobles til overfladen af et større protein, er, at pesticiderne ikke i sig selv er store nok til at kunne frem-
Immunkemi
- mus brugt til analyse for pesticider
Af Leif Bruun og Jens Aamand
Der bruges i dag store summer
på pesticidanalyser som følge
af, at der registreres et stigende
antal forureninger med pesti-
cider af vores grundvand. Der er
derfor mange penge at spare,
hvis der kan udvikles billigere
analysemetoder.
I
M
M
U
N
K
E
M
I
Grundvandet er truet af nedsivende pesticider og nedbrydningsprodukter.
F
oto: Jørgen Dahlgaard
14
A k t u e l N a t u r v i d e n s k a b | 3 | 2 0 0 0
N
H
N
N
N
Cl
N
H
N
H
N
N
N
Cl
N
H
O
O
N
O
O
N
H
N
N
N
Cl
N
H
N
O
*
pesticid
modificeret pesticid
protein
Protein med pesticidoverflade
vaccine
mus
milt
miltceller
kræftceller
fusionerede celler
oprenset pesticid-
antistof
Mikrotiterplader
Immunkemisk pesticid-analyse
O
N
O
O
H
Resultat
Boks B.
Det pesticid, man ønsker at udvikle
en immunkemisk analyse for,
syntetiseres med en kemisk modi-
fikation, der gør, at pesticidet kan
sættes fast på et protein. Dette
protein injiceres herefter i mus.
Efter nogle ugers behandling afli-
ves musen, og celler fra milten tvin-
ges til at vokse sammen med kræft-
celler, hvilket resulterer i fusione-
rede celler.
De fusionerede celler undersø-
ges for, om de producerer antistof-
fer mod det rigtige pesticid, og at
antistoffernes bindingsevne til pe-
sticidet er tilstrækkelig.
Udvalgte celler klones og danner
grundlag for en egentlig produktion
af antistoffer. Antistofferne opren-
ses og benyttes til immunkemiske
pesticid-analyser på mikrotiter pla-
der.
Udvikling af antistoffer mod pesticider - boks B
provokere produktion af anti-
stoffer. Immunsystemet er ind- rettet til at bekæmpe større or- ganismer som f.eks. virus eller bakterier, men ved at koble pesti- ciderne til større molekyler er det muligt at "snyde" systemet.
Blodprøver fra musen viser
efterfølgende, om musens im-
munforsvar har reageret mod pesticiderne, og i så fald aflives musen. Milten indeholder mange antistof-producerende celler, og dette organ udtages derfor fra musen, så disse celler kan isoleres. Da det er meget vanskeligt at få disse celler til at vokse i laboratoriet, foretages der en såkaldt "fusion" mellem miltcellerne og kræftceller. Denne fusion resulterer i dan- nelsen af nye celler (hybri- domer), der har arvet evnen til at producere antistoffer fra miltcellerne og evnen til at vokse uhæmmet fra kræftcel- lerne. Hybridomerne kan nu dyrkes i laboratoriet, og ved hjælp af forskellige teknikker kan man identificere, hvilke hybridomer der producerer anti- stoffer mod det pågældende pe-
sticid. De udvalgte hybridomer
gennemgår herefter en såkaldt "kloning", hvor man sikrer sig, at den cellekultur, man arbejder videre med, kun består af én slags celler. Den endelige celle- kultur kan opbevares i fryser i mange år, og kan til enhver tid tages op for at producere anti- stoffer mod pesticidet, der der- efter kan danne udgangspunkt for immunkemiske analyser.
Immunkemisk analyse for
pesticider
En immunkemisk pesticid-
analyse kan opsættes på flere forskellige måder. Ofte anven- des såkaldte mikrotiter-plader (se boks B), der er små form- støbte plastikplader med 96 brønde. Til bunden af brøndene bindes (immobiliseres) det pesti- cid, som antistoffet kan gen- kende (boks A). Antistofferne vil herefter reagere med både det pe- sticid, der findes immobiliseret til bunden af brønden, og til det pesticid, der findes frit i vand- prøven. Mængden af antistof der bindes til bunden af brøn- den vil dog afhænge af, hvad
Meget forurenet
prøve
Lavt signal
vask
Lidt forurenet
prøve
Højt signal
vask
antistof
pesticid
Pesticidpræpareret overflade
signalmolekyle
Boks A. Princippet ved en immunkemisk pesticid-analyse:
Den pesticidpræparerede overflade symboliserer indersiden af en brønd på en såkaldt mikrotiter- plade. Til en sådan brønd til- sættes prøven (typisk 150 µl) samt noget antistof. Antistofferne reagerer både med pesticiderne fra prøven og pesticiderne der sidder fast på den præparerede overflade. Herefter vaskes overskydende prøve og antistof ud af brøn- den, og ved hjælp af signalmolekylerne kan man bestemme, hvor meget antistof, der sidder tilbage. Mængden af tilbageble- ven antistof giver et mål for, hvor meget pesticid der var i prøven.
I
M
M
U
N
K
E
M
I
15
A k t u e l N a t u r v i d e n s k a b | 3 | 2 0 0 0
der oprindeligt var i prøven.
Man taler om, at der er en kon- kurrence mellem antistoffernes reaktion med det bundne pesti- cid og pesticidet i prøven.
Hvis der er meget pesticid i
prøven, vil antistoffet hovedsa-
geligt binde til det "frie" pesti- cid fra prøven. Hvis der deri- mod kun er lidt pesticid i prø- ven, vil antistoffet hovedsageligt binde til den præparerede over- flade på mikrotiter-pladen. Man får derfor en omvendt proportio- nalitet mellem mængden af pesticid i prøven og det signal, analysen afgiver til laboratoriet. Jo mere antistof, der har bundet til mikrotiter-pladen, des mere signal genereres der. Signalmole- kylerne kan være alt fra enzymer til fluorescerende molekyler.
Ulemper
Problemet med at anvende
antistoffer til pesticidanalyser er, at mange af de pesticider, vi analyserer for, ligner hinanden i strukturen. Som et glimrende eksempel på dette kan nævnes triazinerne, hvor udvalgte ek- sempler er vist i boks C. Det betyder, at har man anvendt et pesticid som atrazin som vac- cine, så risikerer man, at de ud- viklede antistoffer også kan rea- gere med simazin, som struktu- relt er nært beslægtet med atrazin. Dette kaldes i fagkredse "krydsreaktion". Antistoffer kan have bindingslommer, der populært kan sammenlignes med en handske til en hånd. Udseendet og egenskaberne af den bindingslomme, som et gi- vent antistof er udstyret med, er afhængig af, hvordan vaccinen blev fremstillet. F.eks. er det meget vigtigt, hvordan pestici- det var orienteret på vaccinen. Ved at anvende bestemte orien- teringer af f.eks. atrazin kan man nogenlunde styre, hvilke antistoffer der kommer ud i sidste ende. Boks D viser en simplificeret skitse af, hvordan antistoffer med forskellige bin- dingslommer kunne tænkes at reagere med diverse triaziner.
Hvor står vi i dag?
GEUS Danmarks og Grøn-
lands Geologiske Undersøgelse har i et samarbejde med Sta-
Boks D. Atrazin kan orienteres på flere måder, når det sættes fast på det
protein, man injicerer i musen. Afhængig af denne orientering, kan man
forestille sig de viste 3 antistoffer med hver deres måde at binde atrazin
på. Dette får indflydelse på, hvilke pesticider hvert antistof vil reagere
med, når de anvendes i en immunkemisk analyse.
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
OH
N
N
N
N
N
OH
N
N
N
N
N
Cl
N
N
C
N
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
OH
N
N
Cl
Cl
NH
2
O
simazin
atrazin
propazin
terbutylazin
cyanazin
hydroxy-
atrazin
hydroxy-
simazin
hydroxy-
propazin
BAM
Cl
Cl
O
OH
O
N
H
O
N
S
O
O
P
OH
O
OH
NH
O
OH
Cl
O
OH
O
P
OH
O
OH
NH
2
dichlorprop
mechlorprop
bentazon
glyphosat
AMPA
Kemiske
strukturer
Boks C. De kemiske strukturer
for udvalgte pesticider: De før-
ste 5 pesticider hører til grup-
pen triaziner. De næste tre stof-
fer er vigtige nedbrydnings-
produkter fra simazin, atrazin og
propazin. Det sidste stof er
nedbrydningsproduktet, BAM
som stammer fra pesticidet
dichlobenil. Der arbejdes i øje-
blikket på at udvikle immun-
kemiske analyser for de pestici-
der, som er vist nederst.
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
Cl
N
N
N
N
N
Cl
N
N
Pesticider
Atrazin
Hydroxy atrazin
Simazin
Cyanazin
Terbytylazin
Propazin
Antistoffer
Antistoffers krydsreaktion mellem forskellige pesticider - boks D
I
M
M
U
N
K
E
M
I
16
A k t u e l N a t u r v i d e n s k a b | 3 | 2 0 0 0
tens Serum Institut og biotekvirk-
somheden Exiqon A/S forsket de sidste 3 år i udviklingen af nye antistoffer mod pesticider. Denne forskning har i dag resul- teret i en række antistoffer, der reagerer på forskellig måde med diverse triaziner (Tabellen: anti- stof 1-10) og det kendte pesti- cid-nedbrydningsprodukt: BAM (11). Markeringerne med "
*
"
angiver, hvilke analyser GEUS
benytter i dag. Denne forskning har de seneste 10 år også været foretaget af mange internatio- nale forskergrupper. Dette har bevirket, at der i dag eksisterer antistoffer mod triaziner og mange andre pesticider verden
Boks E.
En vandprøve tænkes påsat i et
applikationsfelt på chippen. Her-
efter vil kapillære kræfter føre
prøven gennem chippen og for-
dele den i forskellige reaktions-
kamre. Hvert kammer indehol-
der antistoffer mod enten én el-
ler flere pesticider og det er må-
let at man efter en kort analyse-
tid har et kvantitativt estimat for
hvilke pesticider eller grupper af
pesticider der er tilstede i prø-
ven. Sådanne chips vil også
kunne indbygges i rutine-
prægede apparaturer.
prøve påsætning
spild
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1: Triazingruppe 1
2: Triazingruppe 2
3: Triazingruppe 3
4: BAM
5: Mechlorprop
6: Dichlorprop
7: Bentazon
8: Glyphosat
9: AMPA
10: andre
11: andre
1 cm
Råskitse for opsætningen af en pestici-chip - boks E
over. Grunden til, at der i tabel-
len er angivet flere triaziner ud for nogle af antistofferne er, at disse antistoffer krydsreagerer mellem de angivne triaziner. Dvs. benytter man f.eks. antistof 5 til en pesticidanalyse, vil man ikke kunne vide, om resultatet stam- mer fra simazin eller atrazin. En pesticidanalyse, der benytter anti- stof 11, vil således kun give svar for eventuelle mængder af BAM og ingen andre pesticider. Derfor har de immunkemiske analyser et problem, hvis man ønsker en på- lidelig analyse for flere forskellige pesticider i samme vandprøve. Det er blandt andet derfor, at man i dag hovedsageligt benytter dyrere kromatografiske metoder til kontrol af drikkevandet.
Hvad vil fremtiden bringe ?
For at kunne hamle op med de
kromatografiske metoder har GEUS indledt et samarbejde
med Statens Serum Institut,
Exiqon A/S samt de to DTU institutter: MIC og IMT. Dette samarbejde har til formål at ud- vikle en pesticid-chip som ger- ne skulle kunne måle for flere pesticider på én gang. I den for- bindelse skal der også udvikles nye antistoffer mod bl.a. glyphosat (boks C).
Pesticid-chippen (boks E)
skal konstrueres på en sådan
måde, at de forskellige anti- stoffer hver for sig reagerer med vandprøven. Dette kan styres vha. af mikroflow-syste- mer og kapillære kræfter, som fører prøven gennem chippen og ud i samtlige antistof- kamre (boks E 9: 1-11). Det er ikke urealistisk, at en sådan analyse kun vil tage omkring 30 minutter at udføre og til en brøkdel af den pris, det ko- ster at få foretaget pesticid- analyser i dag.
F
oto: GEUS
Leif Bruun er projektforsker
e-post: lbr@geus.dk tlf.: 38 14 23 17
Jens Aamand er seniorforsker,
e-post: jeaa@geus.dk Tlf.: 38 14 23 26
Geokemisk afdeling
GEUS - Danmarks og Grøn- lands Geologiske Undersøgelse Thoravej 8 2400 København NV Tlf.: 38 14 20 00
http://www.geus.dk
I
M
M
U
N
K
E
M
I
Anti-
Pesticid
Evt. analyses
stof
detektionsgrænse
1
atrazin, simazin
0,02 µg/l *
2
cyanazin, terbutylazin
0,03 µg/l
3
simazin, cyanazin, atrazin, terbutylazin
0,03 µg/l
4
atrazin, terbutylazin
0,06 µg/l
5
simazin, atrazin
0,05 µg/l
6
atrazin
0,05 µg/l
7
simazin
0,05 µg/l
8
cyanazin, propazin, terbutylazin
0,01 µg/l *
9
cyanazin
0,07 µg/l
10
hydroxypropazin, hydroxyatrazin, hydroxysimazin 0,01 µg/l *
11
BAM
0,02 µg/l *
Tabel:
Antistoffer
Rent drikkevand direkte fra hanen er et gode.
|